安諾優(yōu)達三代測序助力茶樹(shù)單體型基因組組裝及演化史解析

2021年7月15日，由福建農林大學(xué)、中國農業(yè)科學(xué)院（深圳）農業(yè)基因組研究所等多家單位共同合作在國際頂級期刊Nature Genetics上發(fā)表“Haplotype-resolved genome assembly provides insights into evolutionary history of the tea plant Camellia sinensis”的文章，該研究利用自主開(kāi)發(fā)的新算法破譯了高雜合鐵觀(guān)音的基因組組裝難題，并在此基礎上闡釋了等位特異性表達應對”遺傳負荷”的機制及茶樹(shù)群體進(jìn)化和馴化歷史，為茶樹(shù)育種改良提供了新見(jiàn)解。安諾優(yōu)達為本次研究提供二代和PacBio三代建庫測序服務(wù)。

文章名稱(chēng)：Haplotype-resolved genome assembly provides insights into evolutionary history of the tea plant Camellia sinensis

發(fā)表時(shí)間：2021年7月15日

發(fā)表雜志：Nature Genetics

研究物種：茶樹(shù)（Camellia sinensis）

影響因子：38.330

                                                研究背景

茶葉作為一種全球性的經(jīng)濟作物，有很強的保健作用。茶樹(shù)是無(wú)性繁殖的，這種方式可以有效地維持因有性重組而分離或丟失的有價(jià)值的基因型。然而，這種繁殖方式也會(huì )積累大量有害突變，導致“穆勒棘輪”效應，致使作物遭受損失。茶樹(shù)是二倍體，含有15對同源染色體，嵌合式的基因組組裝（篩選同源染色體中的一份拷貝作為代表組裝到染色體水平）可能會(huì )錯過(guò)重要選擇性狀的等位變異，而分型組裝（不同親本的兩套同源染色體同時(shí)組裝到染色體水平）能更完整地呈現二倍體基因組的全部遺傳信息。本文通過(guò)對中國烏龍茶品種鐵觀(guān)音及幾個(gè)主要的茶樹(shù)品種和近緣物種進(jìn)行測序及單體型組裝，探索地理上不同的茶樹(shù)群體之間的遺傳多樣性，為深入了解茶樹(shù)的馴化史和進(jìn)化史提供依據。

                                              樣本選擇

山茶植株芽、根、莖、花、幼葉和成熟葉

                                             測序策略

DNA：

PacBio Sequel II平臺基因組測序 114X

Illumina NovaSeq 150 bp雙端測序，DNA小片段文庫

Illumina NovaSeq，Hi-C文庫 99.4X

RNA：

PacBio Sequel II平臺，Iso-Seq文庫

                                                研究思路

                                             研究結果

1.基因組組裝與注釋

鐵觀(guān)音的基因組大小約為3.15 Gb，雜合度為2.31%。利用PacBio長(cháng)讀長(cháng)對原始數據進(jìn)行組裝得到初始contig，大小為5.41 Gb。將Khaper算法過(guò)濾產(chǎn)生的單倍體組裝結果掛載到15個(gè)染色體（圖1），得到單倍體參考基因組（monoploid reference genome），大小為3.03 Gb。同時(shí)利用ALLHiC算法得到鐵觀(guān)音單體型基因組（haplotype-resolved genome），大小為5.98 Gb。共線(xiàn)性分析顯示它們的基因順序高度一致。

圖1鐵觀(guān)音基因組組裝和質(zhì)量評估

（a）單倍體參考基因組circos圖，呈現15條染色體特征；（b）Hi-C熱圖呈現15條染色體組裝質(zhì)量；（c）LAI（LTR Assembly Index）評估鐵觀(guān)音基因組和已發(fā)表茶樹(shù)基因組組裝質(zhì)量；（d）鐵觀(guān)音單倍體參考基因組和單體型基因組的共線(xiàn)性比較

2.等位基因特異性表達

利用鐵觀(guān)音不同組織的全基因組測序，分離得到14,691個(gè)等位基因（圖2），其中1,528個(gè)基因存在一致性的等位特異性表達（consistent allele-specific expression,  ASEGs），即一個(gè)等位基因在所有組織和樣本中的表達都高于另一等位基因?；蚋患治鲲@示這些基因參與核糖體等多個(gè)生物學(xué)基本過(guò)程，與克服有害突變的潛在機制相關(guān)。同時(shí)還發(fā)現了386個(gè)非一致的ASEGs，它們在不同組織的等位基因之間存在特異性表達。其中幾個(gè)基因與揮發(fā)性有機化合物的生物合成有關(guān)，包括黃酮和黃酮醇等的生物合成途徑，這與植物的適應性演化相關(guān)。結果表明，在鐵觀(guān)音基因組中，一致性的ASEG明顯多于不一致的ASEG（1,528 vs 386），這一趨勢與雜交水稻的結果正好相反，即在雜交水稻中，不一致的ASEG遠遠大于一致性的ASEG。這種現象或許可以用雜種優(yōu)勢理論中的顯性效應解釋?zhuān)L(cháng)期無(wú)性繁殖的茶樹(shù)利用優(yōu)勢等位基因應答不斷積累的遺傳負荷，以保持個(gè)體的適應度。

圖2 茶樹(shù)單倍型基因組等位不平衡

(a) 兩個(gè)單倍型序列的比對（10 Mb非重疊的窗口）；（b）等位基因CDS序列比較；（c）等位基因的選擇壓力分析；（d）等位基因的非同義替換位點(diǎn)數目分布；（e）等位特異性表達基因（ASEGs）在茶樹(shù)葉片中的表達情況；（f）舉例說(shuō)明一致性的ASEGs（CsSRC2）；（g）舉例說(shuō)明非一致的ASEGs（CsGGPS1）

3.茶樹(shù)遺傳變異和群體結構分析

通過(guò)對161份茶樹(shù)種質(zhì)資源重測序數據分析，發(fā)現樣本主要分為三類(lèi)（圖3），分別為大理茶，大葉茶和小葉茶，與茶樹(shù)的形態(tài)學(xué)分類(lèi)一致。另外大葉茶可以分類(lèi)古大葉茶和栽培大葉茶；而小葉茶依據地理分布可分為四個(gè)亞組，分別為SSJ（陜西，四川，江西），ZJNFJ（浙江和福建北部），SFJ（福建南部），HHA（湖北，湖南和安徽）。TreeMix分析發(fā)現這些茶樹(shù)之間存在顯著(zhù)的基因流動(dòng)，表明種內基因交流頻繁，其中一些與有記錄的茶樹(shù)雜交育種歷史相吻合。

圖3茶樹(shù)群體系統進(jìn)化與群體結構分析

（a）重測序樣本的地理分布；（b）群體系統發(fā)育樹(shù)；（c）PCA主成分分析；（d）群體遺傳結構分析（k=7）

4.大葉茶和小葉茶的進(jìn)化史和馴化史

對14種山茶屬植物的21株單株進(jìn)行了全基因組測序，通過(guò)群體遺傳分析發(fā)現大葉茶和小葉茶具有不同的進(jìn)化史。在Gelasian epoch時(shí)期（259-181萬(wàn)年前），劇烈的氣候變化很可能導致了整個(gè)茶樹(shù)物種（包括大葉茶和小葉茶）的群體收縮；兩個(gè)變種分化后，僅小葉茶在Last Glacial Maximum時(shí)期（2.65-1.9萬(wàn)年前）可能由于溫度驟降出現了再一次的群體收縮，但隨后適應了環(huán)境的小葉茶迅速擴張，群體規模得到恢復。該分析表明，大葉茶和小葉茶分化后的進(jìn)化史不同（圖4）。通過(guò)對大葉茶和小葉茶馴化基因的分析，發(fā)現它們的馴化過(guò)程是并行的（即獨立馴化），這些馴化基因參與了一系列重要的生物學(xué)過(guò)程且受人工選育的偏好性影響?；贙EGG分析，在大葉茶馴化早期以參與氧化石墨烯苷轉運、糖苷轉運通路為主，后期品種改良主要集中在合成生物堿和芳香化合物等。例如，研究人員鑒定到CsXDH基因在大葉茶品種改良階段受到強烈的人工選擇，該基因編碼黃嘌呤脫氫酶，是咖啡因合成通路的重要基因。而小葉茶品種的早期馴化與植物抵御相關(guān)，改良過(guò)程主要集中在花發(fā)育的調控和對一氧化氮的響應，已有研究表明，NO的積累可以加速γ-氨基丁酸的消耗從而幫助植物抵御冷脅迫，這表明篩選耐寒的品種也是人工選育的重要目標。

圖4大葉茶和小葉茶的平行馴化

（a）平行馴化模式圖；（b）全基因組的選擇性清除信號；（c-f）重要基因的人工選擇信號（XDH，CM，F3’H，BAS1，DWF4）；（g）人工選擇基因的表達情況

小結

本研究成功組裝了兩套鐵觀(guān)音基因組（單倍體參考基因組和單體型基因組）。通過(guò)對等位基因特異性表達的分析，預測顯性效應可能是鐵觀(guān)音應對遺傳負荷的重要機制。通過(guò)對茶樹(shù)種群水平的遺傳分析，揭示了該物種的進(jìn)化和人工馴化歷史。該成果為利用組學(xué)分析和分子生物學(xué)技術(shù)挖掘功能基因、解析其背后的遺傳調控機制，開(kāi)展基于大數據驅動(dòng)的基因組智能設計育種奠定了堅實(shí)的理論基礎，同時(shí)也為縮短育種周期、提高育種效率、降低育種成本提供了科學(xué)依據。

作為國內基因組行業(yè)知名企業(yè)，安諾基因擁有實(shí)力強大的測序服務(wù)平臺，配備系列先進(jìn)儀器設備，三代PacBio（1臺Sequel IIe+7臺Sequel II+10臺Sequel）為您的科研之路保駕護航；專(zhuān)業(yè)的生物信息分析團隊，豐富的項目分析經(jīng)驗，讓您的數據分析之途無(wú)憂(yōu)。安諾基因已與中國農業(yè)大學(xué)、中科院遺傳與發(fā)育所、中國海洋大學(xué)、中國農業(yè)科學(xué)院、福建農林大學(xué)等多家科研院所開(kāi)展了深度合作，助力基因組文章發(fā)表于Nature、Nature Plants、Nature Communications、Molecular Plant、Communications Biology、The Plant Journal等多個(gè)國際高水平期刊。

參考文獻：

Zhang X, Chen S, Shi L, et al. Haplotype-resolved genome assembly provides insights into evolutionary history of the tea plant Camellia sinensis [published online ahead of print, 2021 Jul 15].Nat Genet. 2021;10.1038/s41588-021-00895-y.

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